高效液相色譜根據(jù)壓力等級(jí)可分為3類(lèi)：正相高效液相色譜儀（耐壓5000-6000psi）、反相高效液相色譜儀（耐壓9000-10000psi）和超高效液相色譜儀(超高效液相色譜儀)（耐壓12000，甚至達(dá)到15000psi以上）。

1，正相高效液相色譜儀

這并不是常用的高效液相色譜方法。正相高效液相使用非極性溶劑作為流動(dòng)相，硅膠顆粒作為固定相。在常規(guī)高效液相色譜儀中，與非極性化合物相比，極性化合物在固定相中會(huì)更長(zhǎng)時(shí)間地粘附在極性有機(jī)硅上。因此，非極性化合物在正常高效液相色譜儀中的洗脫速度更快。孔徑一般在3微米左右。

正相色譜法技術(shù)原理： 采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑（烷烴類(lèi)如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三*甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類(lèi)、胺類(lèi)、羰基類(lèi)及氨基酸類(lèi)等）。

2，反相高效液相色譜儀

這是常見(jiàn)的高效液相色譜類(lèi)型。在反相高效液相中，固定相被烴鏈（通常長(zhǎng) 8-18 個(gè)碳）改性，導(dǎo)致色譜柱變?yōu)榉菢O性。也使用極性溶劑。在反相高效液相色譜儀中，樣品中的極性分子會(huì)與溶劑產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸引力，從而使它們更快地洗脫。它們也不會(huì)與非極性固定相相互作用。非極性化合物會(huì)與固定相產(chǎn)生范德華力和分散相互作用，因此它們的洗脫速度較慢。

反相色譜法技術(shù)原理： 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用更為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。

3，超高效液相色譜儀

這類(lèi)高效液相色譜運(yùn)行速度更快、使用的溶劑更少且分辨率更高。色譜柱也更小，固定相顆粒的尺寸要小得多。較小的孔（亞 2 微米）促進(jìn)了分子更好的分離和分辨率。較短的色譜柱還可以進(jìn)行快速檢測(cè)。然而，超高效液相色譜不能用于干燥或未過(guò)濾的樣品，因?yàn)檩^小的孔會(huì)堵塞，這是一個(gè)昂貴且耗時(shí)的修復(fù)過(guò)程。

填料材料的新進(jìn)展已經(jīng)開(kāi)始在高效液相色譜儀和超高效液相色譜儀之間創(chuàng)建中間解決方案。核殼顆粒是目前市場(chǎng)上的一種此類(lèi)填充材料。使用核殼顆粒的效率與使用亞 2 微米顆粒的效率相同，但可以在低得多的壓力下運(yùn)行。甚至有人猜測(cè)這些效率可以在標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜儀機(jī)器上產(chǎn)生。

高效液相色譜機(jī)器通常包含一個(gè)紫外線檢測(cè)器來(lái)測(cè)量樣品中分子發(fā)出的紫外線。但是，某些高效液相色譜儀機(jī)器可以與質(zhì)譜儀 (MS) 結(jié)合使用。使用 HPLC-MS 時(shí)，可以通過(guò) m/z 比來(lái)識(shí)別分子，而無(wú)需知道保留時(shí)間。